熒光定量pcr技術(shù)原理及步驟

　　熒光定量PCR技術(shù)是一種在PCR擴增反應(yīng)體系中加入熒光基團，通過實時監(jiān)測每一個循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號，從而實現(xiàn)對起始模板的定量及定性分析的技術(shù)。熒光定量PCR的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，這些熒光基團會隨著PCR反應(yīng)的進行而釋放出熒光信號。通過實時監(jiān)測這些熒光信號的強度變化，可以反映出PCR反應(yīng)的進程和結(jié)果。具體來說，在PCR反應(yīng)的指數(shù)期，模板的Ct值（即達到設(shè)定閾值時的循環(huán)數(shù)）和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，因此可以通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)樣品的Ct值在該曲線上確定其所含起始模板的數(shù)量。

　　

　　1、設(shè)計并合成引物：這是目標(biāo)基因引物的設(shè)計和合成，確保其特異性和有效性。引物是PCR擴增的關(guān)鍵，它們決定了PCR反應(yīng)能否成功擴增出目標(biāo)基因。

　　

　　2、準(zhǔn)備反應(yīng)體系：將引物、模板DNA、熒光標(biāo)記的探針或染料以及其他必要的反應(yīng)成分混合在一起，形成PCR反應(yīng)體系。其中，熒光標(biāo)記的探針或染料用于后續(xù)的熒光檢測。

　　

　　3、進行PCR反應(yīng)：將反應(yīng)體系置于PCR儀中，按照設(shè)定的程序進行PCR擴增。在擴增過程中，熒光信號會隨著PCR產(chǎn)物的增加而逐漸增強。

　　

　　4、實時檢測和定量：在PCR反應(yīng)進行的同時，實時監(jiān)測每個循環(huán)結(jié)束時的熒光強度。當(dāng)檢測到的熒光信號超過設(shè)定的閾值時，記錄此時的循環(huán)數(shù)（Ct值）。Ct值與起始模板的量成反比，即起始模板量越多，Ct值越小。

　　

　　5、數(shù)據(jù)分析：根據(jù)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中目標(biāo)基因的起始拷貝數(shù)或相對表達量。這一步驟通常由專門的軟件完成。

　　

　　熒光定量PCR技術(shù)以其高靈敏度、高特異性以及能夠?qū)崿F(xiàn)實時定量的特點，在生物醫(yī)學(xué)研究、疾病診斷、藥物研發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。